乳がんは女性の悪性腫瘍の中で最も死亡原因の上位を占めており、常に医学研究の重要な焦点となっています。現在、乳がん患者に対する最も一般的な全身治療は細胞傷害性化学療法です。この療法はある程度の症状緩和をもたらしますが、がん細胞の再発や転移は依然として起こり得ます。

これまでの研究で、乳がん幹細胞（BCSC）が乳がんの化学療法および放射線療法に対する抵抗性の根本原因であることが示されています。BCSCは乳がん細胞のごく一部を占めるに過ぎませんが、驚くほど無限の増殖能と腫瘍を誘導する能力を有しています。さらに憂慮すべきことに、化学療法の過程自体が非BCSC細胞のBCSCへの変換を促進し、腫瘍の再発および転移のリスクを悪化させる可能性があります。

したがって、乳がん患者の予後を改善するには、化学療法に対するBCSCの反応メカニズムを深く理解することが不可欠です。既存の治療選択肢を最適化するために、BCSCを同定・阻害する方法が臨床的に緊急に必要とされています。

この課題に取り組むため、山東大学の呂海泉、孫容、張凱、そして山西医科大学の梅奇からなる研究チームは、ヘリカルマトリックステクノロジーをはじめとする研究グループと共同で、画期的な進歩を遂げました。機械学習技術を活用し、mRNA解析に基づいて、原発性乳がん患者サンプル中のがん幹細胞の特性を評価する新たな手法、すなわちBCSCシグネチャーの開発に成功しました。この研究は、BCSC制御におけるポリアミン同化代謝の中核的役割を明らかにするだけでなく、乳がんの臨床治療に全く新しい戦略と方向性をもたらすものです。

「ポリアミン同化作用は化学療法誘発性乳がん幹細胞の濃縮を促進する」と題されたこの研究は、国際的に有名な学術誌「アドバンスト・サイエンス」に掲載された。

研究のハイライト:

• 研究者らは、機械学習手法を使用して、乳がん患者のサンプル中のがん幹細胞の特性を評価するための mRNA ベースの BCSC シグネチャを開発しました。
• この研究では、ポリアミン合成が BCSC の調節に重要な役割を果たしており、化学療法は HIF-1 調節ポリアミン合成経路を活性化することで BCSC の蓄積を促進することがわかりました。
• この研究では、新たな特異的 HIF-1 阻害剤であるブリタニンが発見されました。ブリタニンは、他の薬剤と併用することで、化学療法誘発性の HIF-1 転写活性、ポリアミン代謝レベル、および BCSC 濃縮を効果的に阻害します。

論文の宛先:
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202404853

TCGA データセットを使用して、ピアソン相関分析と機械学習アルゴリズム間の相関関係を構築しました。

本研究では、原発性乳がん患者サンプルの幹細胞特性を遺伝子発現レベルから定量化するために、Cancer Genome Atlas Consortium（TCGA）の浸潤性乳がん（BRCA）データセットを利用しました。ピアソン相関係数分析により、mRNA発現と単変量ロジスティック回帰（OCLR）機械学習アルゴリズムに基づくmRNA幹細胞指数（mRNAsi）との相関関係を明らかにし、mRNAベースのBCSCシグネチャーを開発しました。

さらに、本研究では2,032人の乳がん患者のデータセットに基づいてカプランマイヤー曲線を作成しました。これらのデータは、原発腫瘍におけるBCSCのP-SigおよびN-Sig発現の層別化と、化学療法を受けた1,372人の乳がん患者のデータセットから作成されました。

具体的には、以下の図 A に示すように、この研究ではまず、ピアソン相関係数 r>0.70 を持つ 81 個の遺伝子と、ピアソン相関係数 r<-0.70 を持つ 91 個の遺伝子を特定し、それぞれ BCSC 陽性シグネチャ (P-Sig) と陰性シグネチャ (N-Sig) として定義しました。

BCSC署名の開発

次に、下の図 B に示すように、本研究では、BCSChigh データセットと BCSClow データセットを比較し、BCSC シグネチャ発現に基づいてグループを層別化することにより、ランキングベースの遺伝子セットエンリッチメント解析 (GSEA) を実行しました。

TCGA BRCA患者サンプルに基づくGSEA分析

研究者らは、2,032人の患者におけるBCSCシグネチャー発現と無再発生存期間（RFS）との相関関係を分析した結果、図Cに示すように、BCSC P-Sig発現が中央値を超える患者はRFSが有意に低く、BCSC N-Sig発現が中央値を超える患者はRFSが上昇することを発見しました。

TCGA BRCA患者サンプルに基づくカプランマイヤー分析

この研究では、国際乳がん協会分子分類データベース（METABRIC）に登録されている乳がん患者1,979人のデータも解析しました。図Dに示す結果は、5年以内に転移を起こした患者は、転移を起こさなかった患者と比較して、原発腫瘍におけるBCSC P-Sigの発現が高く、BCSC N-Sigの発現が低いことを示しています。

Metabricデータベースの分析と比較

さらに、下図Eに示すように、本研究では様々な乳がん細胞株におけるBCSCの特性も検証しました。標準的なポリスチレン組織培養皿で培養した細胞と比較して、乳腺球培地で培養した乳がん細胞は、BCSC P-Sigの発現が高く、BCSC N-Sigの発現が低かったことが示されました。

BCSC における P-Sig および N-Sig 遺伝子の mRNA 発現レベルは、qPCR 技術を使用して検出されました。

本研究では、化学療法薬が乳腺乳がん細胞集団に及ぼす影響を評価するため、ヒト乳がん細胞MDA-MB-231を雌の重症複合免疫不全（SCID）マウスの乳腺脂肪組織（MFP）に注入し、パクリタキセルを投与した。図F、G、Hに示すように、パクリタキセルはアルデヒド脱水素酵素活性（ALDH+）細胞の割合と乳腺グロブリン形成細胞数を有意に増加させた。

ALDH+および乳腺糸球体の検出と分析

一方、下の図 I では、RNA-seq 解析により、パクリタキセル治療によってほとんどの BCSC P-Sig 遺伝子の発現が増加し、ほとんどの BCSC N-Sig 遺伝子の発現が減少することが示されました。

RNAシーケンシング

下図Jに示すように、本研究ではパクリタキセルに加えて、FDA承認の化学療法薬であるゲムシタビンとカルボプラチンを用いて乳がん細胞を治療しました。これらの薬剤は、BCSC P-Sig遺伝子の発現を上昇させ、BCSC N-Sig遺伝子の発現を低下させました。下図Kに示すように、Metabricの患者から採取したサンプルでは、​​術前化学療法を受けた患者において、原発腫瘍組織におけるBCSC P-Sig遺伝子の発現が高く、BCSC N-Sig遺伝子の発現が低いことも示されました。

乳がん細胞株に対するさまざまな治療法の比較

ポリアミン生合成は BCSC の増加と正の相関関係にあり、HIF-1 阻害剤のブリタニンはポリアミン生合成を抑制し、BCSC を根絶することができます。

本研究では、細胞代謝の観点から化学療法がBCSC増加を誘発するメカニズムを探るため、 TCGA BRCAの患者21名をBCSC特性発現に基づいてBCSChigh群とBCSClow群に分け、両群間で399種の代謝物のレベルを比較しました（下図A参照）。

TCGA BRCA乳がん患者23名における代謝物情報の比較

下の図 B に示すように、この研究では代謝経路エンリッチメント解析を通じて、ポリアミン合成関連経路でさまざまなレベルの代謝物のエンリッチメントが発生していることが実証されました。

代謝物の体積濃縮分析（MPEA）

下図CおよびDに示すように、本研究では、オルニチン脱炭酸酵素1（ODC1）、ヒトスペルミジン合成酵素（SRM）、スペルミン合成酵素（SMS）といったポリアミン生合成経路の主要酵素の発現が、BCSChigh群ではBCSClow群よりも高かったことが明らかになりました。さらに、これらの酵素の発現は、非接着乳がん細胞株上で球状培養した方が単層培養よりも高く、ポリアミン生合成がBCSCの表現型制御において重要な役割を果たしていることが示唆されました。一方、下図Eに示すように、パクリタキセル処理は乳がん細胞株におけるODC1およびSRMの発現を増加させました。

ポリアミン合成および代謝分析

さらに、下図Gに示すように、本研究では山東大学齊魯病院の脱感作乳がん患者34名からもサンプルを採取しました。分析の結果、術前化学療法を受けている患者では、細胞内オルニチンおよびポリアミン濃度が有意に上昇していることが明らかになりました。これらの研究はすべて、ポリアミンの相乗効果の増強が化学療法誘発性乳がん細胞（BCSC）の濃縮を促進することを示唆しています。

原発性乳がん患者サンプル中のポリアミン代謝物の測定

乳がんにおける化学療法がポリアミン合成を促進する分子メカニズムをさらに解析するため、本研究では、低酸素誘導因子（HIF-1α）の阻害がパクリタキセルを介したALDH+の上昇と球状化を弱め、 BCSCのP-Sig遺伝子の発現を大部分減少させ、BCSCのN-Sig遺伝子の発現を大部分増加させることを明らかにしました。これは、図ACに示すように、HIF-1がパクリタキセル誘導性BCSC集積の制御に重要な役割を果たしていることを示しています。

パクリタキセル治療後のALDH+の検出

図DGに示すように、BCSCの表現型制御におけるHIF-1の役割をさらに調査するため、本研究ではHIF-1発現蛍光追跡システムを用いてMDA-MB-231細胞にトランスフェクションを行った。パクリタキセルを投与したマウスの腫瘍組織を採取し、細胞をDsRed+/GFP−（HIF-1−）細胞集団とGFP+（HIF-1+）細胞集団に分けた。DsRed +/GFP−細胞集団と比較して、高いHIF-1発現と転写活性を示すGFP+細胞集団は、BCSC P-Sig遺伝子発現の増加とBCSC N-Sig遺伝子発現の低下を示した。さらに、GFP+細胞の腫瘍形成能は、未治療群またはDsRed+/GFP−細胞と比較して有意に高かった。

HIF-1発現蛍光追跡研究

以下の図 H および I では、この研究により、HIF-1α を阻害するとパクリタキセル誘導性の ODC1 および SRM 発現がブロックされ、パクリタキセルが HIF-1 依存的にポリアミン合成を促進することがわかりました。

MDA-MB-231サブクローン細胞におけるタンパク質発現およびポリアミンレベルの検出

最後に、この研究では、HIF-1 が ODC1 および SRM 遺伝子を転写活性化することでポリアミンの合成と代謝を促進し、それが下の図 LQ に示すように化学療法誘発性の BCSC の濃縮につながることがわかりました。

MDA-MB-231サブクローン細胞におけるALDH+活性アッセイ

下図Aに示すように、本研究ではHIF-1転写活性レポーターシステムを用いてSUM159細胞にトランスフェクションし、4,320種の天然化合物を含む天然物ライブラリーから新規HIF-1阻害剤をスクリーニングしました。その結果、*Inula aucheriana*由来のブリタニンが用量依存的にHIF-1転写活性を効果的に阻害することが明らかになりました。ブリタニンとパクリタキセルの併用投与は、下図BFに示すように、パクリタキセルによって誘発される細胞内アルギニンおよびポリアミンレベルの上昇を用量依存的に阻害しました。

ブリタニンの化学構造解析と併用療法試験

ブリタニンがHIF-1転写活性を阻害するメカニズムを解明するため（下図HK）、本研究ではMDA-MB-231細胞にHIF-1転写活性レポーターシステムを共導入した。その結果、ブリタニンはパクリタキセル誘導性HIF-1α TAD活性レポーターシステムを用量依存的に減弱させ、また転写活性化因子p300を阻害することでHIF-1転写活性を阻害することが示された。

MDA-MB-231細胞の免疫ブロット法とChIP検出

下図LQに示す本研究では、SCIDマウスに2×10⁶個のMDA-MB-231細胞を注入し、パクリタキセル単独またはブリタニンとの併用で治療しました。その結果、併用療法はマウスの外観や体重に影響を与えることなく、原発腫瘍の増殖を有意に抑制し、10匹中3匹のマウスで治療中止後100日経過しても腫瘍の再発が見られませんでした。これは、パクリタキセルとブリタニンの併用療法がマウスのBCSCを完全に根絶できることを示しています。

SCIDマウスに2×10⁶個のMDA-MB-231細胞を移植する試験

AI支援による病理診断、HER2標的療法が鍵となる可能性。

今日、乳がんの診断は画像診断だけでなく、病理診断も重要な役割を果たしています。乳がん治療において、HER2（ヒト上皮成長因子受容体2）の発現レベルは重要な検討事項であり、AIは病理切片の解析においてHER2の発現レベルを特定し、その後の標的治療の参考情報として活用することができます。

原理はシンプルに見えますが、その実装は容易ではありません。例えば、AI技術を用いて乳がんにおけるHER2の解釈精度と再現性を向上させるには、AIシステムの広範なトレーニングと継続的なデバッグ、そして医療従事者の診断との比較が必要です。これを踏まえ、研究者たちはHER2陰性とHER2陽性の症例を区別することに焦点を当て、AIをHER2発現の下限値に誘導することで、HER2発現の異なる不均一な乳がんの診断におけるAIの価値を評価しています。

実際、早くも2022年に山東大学の呂海泉教授はバイオメディカルジャーナル「Theranostics」に表紙記事を発表し、化学療法と組み合わせてA2BRを標的とすることで乳がん幹細胞の濃縮を阻止し、化学療法後の乳がん患者の生存率を向上させる可能性があることを明らかにしました。

論文リンク:
https://www.thno.org/v12p2598.htm

今回、呂海泉教授はさらに、ブリタニンとの併用によりHIF-1のポリアミン合成代謝を阻害し、BCSCを根絶できることを明らかにしました。これは間違いなく、乳がん治療に全く新しいアプローチを提供するものです。今後、AIは乳がん治療においてかつてないほど重要な役割を果たし、医療・健康分野への応用はますます大きな可能性を示しています。技術の継続的な進歩と応用の深化に伴い、AIは乳がん、ひいてはがん治療全般において欠かせないパートナーとなり、患者にさらなる力と希望をもたらすでしょう。