科学研究の分野では、画期的な進歩によって特定の技術が注目を集めることがよくあります。2017年のノーベル化学賞を受賞したクライオ電子顕微鏡（クライオEM）もその一例です。例えば、2015年、石一公氏のチームはクライオEM技術を用いて、スプライソソームの高解像度構造を初めて捉えました。これは、過去30年間における中国の基礎生命科学分野における世界科学への最大の貢献として高く評価され、クライオEMへの注目を一気に高めました。

構造生物学分野における重要なツールであるクライオ電子顕微鏡は、試料を急速に低温まで冷却することで水分子の結晶化を防ぎ、生理学的状態に近い状態で保存することができます。凍結後、研究者は様々なクライオ電子顕微鏡技術を用いて、様々な解像度（原子レベルに近い解像度を含む）で試料を3D可視化し、試料に関するより深く包括的な理解を得ることができます。

しかし、クライオ電子顕微鏡（クライオEM）の高度化が進む一方で、試料調製における配向優位性の問題は依然として課題となっています。一般的に、3D再構成には、空間全体をカバーするためにあらゆる方向からのタンパク質投影が必要です。しかし、気液界面（AWI）に吸着したタンパク質は、しばしば配向優位性を示し、投影データセットが不完全になり、タンパク質密度の歪みの程度も様々で、再構成の精度が低下します。

最近、 UCLAの研究チームは、Single-Particle IsoNet（spIsoNet）と呼ばれる自己教師型深層学習手法を提案しました。この手法は、サンプルの等方性を復元するための新たなアプローチを提供します。spIsoNetを単粒子クライオ電子顕微鏡に適用することで、生体分子の再構成品質を大幅に向上させ、アライメント精度と角度等方性を高め、構造生物学分野に新たなブレークスルーをもたらすことができます。

「自己教師型ディープラーニングによるクライオ電子顕微鏡(CREM)における優先配向問題の克服」と題されたこの研究は、国際学術誌「ネイチャー・メソッド」に掲載された。

研究のハイライト:

• この研究では、クライオ電子顕微鏡の画像品質を向上させるために使用できる、自己教師型ディープラーニングベースのエンドツーエンド手法 spIsoNet を開発しました。
• spIsoNet は、優先方向の問題によって発生する 3D 再構築の問題を解決できます。
• spIsoNet は、3D 再構築中の角度等方性と粒子配置の精度を向上させます。

論文の宛先:
https://doi.org/10.1038/s41592-024-02505-1

spIsoNetデータセットアドレス:
https://go.hyper.ai/P7XQu

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データセット: それぞれ異なる特性とアプリケーション シナリオを持つ複数のデータセットの選択。

この研究では、研究者はそれぞれ独自の特性とアプリケーション シナリオを持つ複数のデータセットを使用して、spIsoNet のパフォーマンスをテストしました。

• β-ガラクトシダーゼデータセットには、1,513個の側面図粒子と950個の上面図粒子という2つの配向サブセットが含まれています。これらのサブセットは、spIsoNetが配向の影響を受ける画像品質を改善できるかどうかを検証するために使用されました。
• HA トリマー傾斜データセット (EMPIAR-10097):グリッド傾斜戦略を通じて取得され、傾斜した視点方向を提供します。これを使用して、spIsoNet が傾斜したサンプルを処理する能力を評価することができます。
• 傾斜なしHA三量体データセット（EMPIAR-10096）は、傾斜なしグリッド条件下で収集されました。13万個の粒子をインポートし、位置ずれ補正を行うことで、3.45Å解像度の画像が得られました。この画像は、傾斜ありサンプルと傾斜なしサンプルの処理効果の違いを比較するために使用できます。
• 非対称リボソームデータセット (EMPIAR-10406)には、アミカシンと複合した A. baumannii 病原体の 70S リボソームが含まれており、複雑な生体分子構造を処理する際の spIsoNet のパフォーマンスを評価するために使用できます。
• HIV VLPコンピュータ断層撮影データセット（EMPIAR-10164）には、未熟なHIV-1 dMACANCウイルス様粒子（VLP）が3.6Åの解像度で含まれています。本研究では、このデータセットを用いてウイルス粒子の構造を詳細に観察しています。

spIsoNet: U-net ディープラーニング モデルに基づいており、2 つの主要モジュールで構成されています。

spIsoNetは、生物医学画像の復元とセグメンテーションで広く認知されているディープラーニングモデルであるU-netネットワークアーキテクチャに基づくニューラルネットワークを使用しています。図bに示すように、U-netは畳み込みブロックを積み重ねるエンコーダ・デコーダアーキテクチャを用いて構築されています。

spIsoNetはU-netニューラルネットワークアーキテクチャを使用しています

U-net モデルに基づいて、spIsoNet は主に 2 つのモジュールで構成されています。

異方性補正モジュール

研究者らは、クライオ電子顕微鏡（クライオEM）画像の鮮明度を向上させるための異方性補正モジュールを設計しました。図cに示すように、このモジュールは2つのハーフマップ、3次元フーリエ殻相関（3DFSC）ボリューム、および溶媒マスクを入力データとして受け取ります。3DFSCアルゴリズムを統合することで、一貫性損失、等分散損失、ノイズ対ノイズ一貫性損失、ノイズ対ノイズ等分散損失という4種類の損失関数の加重和を最小化し、クライオEM画像の品質を向上させます。

異方性補正アルゴリズムの概略図

異方性補正を利用した位置ずれ補正モジュール

下図eに示すように、このモジュールは、画像フィルタリング、異方性補正、RELION自動リファインという3つの主要なステップを含むワークフローを統合しています。異方性補正はワークフロー全体の中核であり、異方性補正を通じてクライオ電子顕微鏡画像の品質を向上させることを目的としています。

• 異方性補正とは、特定のアルゴリズムを使用して、さまざまな方向にある物体の物理的および化学的特性の差を補正し、等方性効果を実現することを指します。
• 位置ずれ補正技術は、主に、画像処理中に幾何学的な歪みによって生じる画像の位置ずれの問題を修正するために使用されます。

ずれ補正アルゴリズムの概略図

異方性補正後、研究者らはより正確な粒子配向パラメータと、RELIONによって再構成された2枚の半画像を取得しました。これらの半画像は、3Dリファインメントの各反復処理後に、白色化やFSC重み付けなどの後処理フィルタを適用することで、画質をさらに向上させます。次に、spIsoNet異方性補正モジュールがこれらのフィルタ処理された半画像を処理し、補正された半画像は解像度に合わせてローパスフィルタリングされます。これらの2枚のフィルタ処理および補正された半画像は、後続の配向推定の基準として使用されます。

結果: spIsoNetはクライオ電子顕微鏡画像の品質を大幅に向上させた

異方性補正効果は大きい。

研究者らは、spIsoNetの異方性補正モジュールがシミュレーションデータにおける欠損情報を効果的に回復できることを発見しました。そのため、本研究ではまずβ-ガラクトシダーゼを含むRELIONチュートリアルデータセットでspIsoNetをテストしました。

下図jmに示すように、研究者は2次元クラス平均から側面図の粒子と上面図の粒子を選択し、好ましい方向を持つ2つの粒子サブセットを作成し、標準的なRELION 3D再構成を実行しました。テスト結果によると、異方性補正モジュールのみで、上面図または側面図が支配的な方向によって引き起こされる3D再構成アーティファクトを効果的に低減できることが示されています。

β-ガラクトシダーゼに適用された異方性補正画像

• ここで、jl は異なる視点から再構築された 2D 分類マップを指し、km は異なる視点から再構築された 3D 分類マップを指します。

異方性補正および位置ずれ補正技術により、クライオ電子顕微鏡の画質が大幅に向上しました。

これまでの研究では、HA三量体傾斜データセットのクライオ電子顕微鏡画像の品質が理想的ではないことが示されています。spIsoNetの有効性を検証するため、本研究ではまずハーフマップに対して異方性補正を行いました。その結果、補正後の画像品質が大幅に改善され、局所解像度が向上し、ノイズが低減していることが示されました。下の図abに示すように、元の画像では判別が困難だった側鎖密度が、補正後の画像では明確に見えるようになっています。

異なる方法で再構成されたHA三量体のクライオ電子顕微鏡画像

• 左から右の順に、標準的な RELION 改良、異方性補正、異方性補正による位置ずれ補正です。

さらに、下図cfに示すように、位置ずれ補正後の画像では、画像とモデル間のフーリエ殻相関が改善されています。3次元フーリエ殻相関（3DFSC）は球面値（0.991）に近くなっています。また、補正後の画像は、元の画像と比較して、等方性フーリエ殻占有面積（FSO）が大きくなっていることがわかります。

ミスアライメント補正後のHA三量体のクライオ電子顕微鏡画像

• ここで、ce は RELION 間引きと spIsoNet ずれ補正に使用される 3DFSC スライスを表し、df はそれぞれ RELION 間引きと spIsoNet ずれ補正の結果から計算された FSO および Bingham テストの p 値を表します。

位置ずれ修正により、誤って割り当てられた多くの方向を正常に識別し、修正しました。

重大なバイアス配向問題のあるタンパク質データセット（傾斜していない HA トリマー データセット (EMPIAR-10096)）の場合、この研究では、spIsoNet の異方性駆動型ミスアライメント補正モジュールを使用して粒子データセットを処理し、傾斜したデータセットから再構築された HA トリマー画像を参照モデルとして使用します。

下図bfに示すように、位置ずれ補正後、研究者らは正しい形状の画像を取得し、等方性を大幅に改善しました。下図hに示すように、ハーフマップFSC（3.5Å）とモデルマップFSC（3.6Å）で決定された画像解像度は一致しています。

spIsoNetの非歪曲HAトリマーデータセットへの適用

*a - 代表的なクライオ電子顕微鏡画像。b - さまざまな方法で再構成された HA トリマーのクライオ電子顕微鏡画像。c - 標準 RELION を使用して精製された 3DFSC スライス。d - 標準 RELION 精製結果に基づいて計算された FSO および Bingham テストの P 値。e - spIsoNet のミスアライメントを補正した 3DFSC スライス。f - spIsoNet のミスアライメント補正結果に基づいて計算された FSO および Bingham テストの P 値。g - クライオ電子顕微鏡画像から選択されたアミノ酸残基とグリカンの代表的な密度。h - 補正された HA トリマー FSC 曲線。i、j - さまざまな方向の分布結果と対応する cryoEF スコア。

spIsoNet は、非対称粒子および核酸分子を含む粒子の配列の改善に非常に優れた性能を発揮します。

下の図adに示すように、異方性補正後、画像品質は大幅に向上し、密度分布がより連続的になり、局所解像度が向上し、ノイズ干渉が減少しました。この研究では、 70Sまたは80Sリボソームのサブトモグラム平均を基準とし、アライメントの初期解像度を15Åに維持することで、モデルバイアスのない高品質な画像を一貫して取得でき、異方性の影響を効果的に軽減できることが分かりました。

リボソームデータセットにおけるspIsoNetの応用

• a、b - さまざまな再構築方法を使用して再構築されたリボソームマップ。c、d - 適合された原子モデルによる代表的な密度領域 (黄色)。

spIsoNet は、in situ 構造生物学における潜在的な応用が可能です。

サブトモグラムの平均化における spIsoNet の適用を評価するために、本研究では HIV-1 VLP コンピューター断層撮影データセット (EMPIAR-10164) を例として使用します。

下図aに示すように、本研究では標準的なRELION4プロセスにおいて、傾斜角の異なる5つのサブセットを用いて3.7Åの解像度構造を取得しました。その後、ミスアライメント補正を実施することで、下図eに示すように、等方性の3.6Å解像度構造を取得しました。

下の図bhに示すように、構造解析により側鎖密度がさらに明確になり、FSO曲線の3DFSC球形度が高くなり、粒子の配向推定の精度が向上します。

局所断層平均マッピングにおけるspIsoNetの応用

• a - 標準RELIONを使用して再構成されたHIV-1のローカル解像度マップ。 b - 標準RELIONを使用して精製された3DFSCスライス。 c - 標準RELION精製結果に基づいて計算されたFSOおよびビンガム検定のP値。 d - クライオ電子顕微鏡画像から選択されたアミノ酸残基とグリカンの代表的な密度。 e - spIsoNet異方性補正技術を使用して再構成されたHIV-1のローカル解像度マップ。 f - spIsoNetを使用して異方性を補正した3DFSCスライス。 g - spIsoNet異方性補正結果に基づいて計算されたFSOおよびビンガム検定のP値。 h - クライオ電子顕微鏡画像から選択されたアミノ酸残基とグリカンの代表的な密度。

AI + クライオ電子顕微鏡: 強力な技術提携の好例。

過去 2 年間、科学界で非常に議論を呼んでいる話題は、「AlphaFold によって構造生物学は終焉したのか?」というものでした。答えは、もちろん「ノー」です。

AlphaFoldのような構造予測モデルの学習データは、X線回折やクライオ電子顕微鏡といった従来の構造解析手法から得られます。一方、クライオ電子顕微鏡はタンパク質の動態解析に優れており、これはAlphaFoldでは現時点では実現できません。したがって、AlphaFoldのようなAI技術はクライオ電子顕微鏡のような従来の手法を支援できるでしょうか？これは必然と言えるでしょう。

例えば、北京大学の毛有東教授のチームは、2022年という早い時期に、AIベースのクライオ電子顕微鏡を用いて、誘導性プロテアソームが基質分解中間状態から基質阻害中間状態へと瞬時に遷移する様子を捉えることに成功しました。これは、AIベースの4次元再構成技術を時間分解クライオ電子顕微鏡の解析精度向上に応用した世界初の事例です。チームは、主要な疾患に関連する標的タンパク質複合体の原子レベルの機能動態観察を実現し、その成果は「時間分解クライオ電子顕微鏡によるヒトプロテアソームのUSP14制御アロステリー」というタイトルでネイチャー誌に掲載されました。

論文リンク:
https://doi.org/10.1038/s41586-022-04671-8

最近、 ByteDance Researchの研究者らは、CryoSTARと呼ばれる新しい手法を提案しました。これは、タンパク質原子構造のモーダル事前分布をクライオ電子顕微鏡実験データに適用する初の手法です。原子モデル情報を構造正則化として用いて生体分子の立体構造の不均一性を解明し、粗視化モデルと密度マップを出力することで、分子の様々なレベルにおける立体構造変化を示すことができ、動的立体構造解析におけるクライオ電子顕微鏡の応用可能性を大幅に高めます。この成果は「CryoSTAR：クライオ電子顕微鏡異種再構成のための構造事前分布と制約の活用」と題され、Nature Methods誌に掲載されました。

論文リンク:
https://www.nature.com/articles/s41592-024-02486-1

間違いなく、AI とクライオ電子顕微鏡法の組み合わせは構造生物学に新たな章を開き、従来の構造生物学手法を支援する AI テクノロジーの大きな可能性を示しています。