人類と疾病との長きにわたる闘いにおいて、医薬品開発は常に科学探究の最前線にありました。中でも、低分子医薬品は、調製の容易さ、高い細胞浸透性、経口投与の簡便さ、そして製造コストの低さといった利点から、医薬品開発の主力となっています。しかしながら、深い疎水ポケットを持たないタンパク質に対しては、低分子医薬品はしばしば効果を発揮しません。科学の進歩により、独特の三次元構造と高い親和性を持つマクロサイクルは、従来の低分子医薬品では到達が困難な分子標的を調節できるようになり、「アンドラッグ」と呼ばれるタンパク質に対する新たな治療の可能性をもたらしています。

しかし、従来の医薬品開発は天然物の発見やハイスループットスクリーニング技術に依存しており、時間とコストがかかります。AIの発展は医薬品設計に新たなブレークスルーをもたらしました。最近、 2024年のノーベル化学賞を受賞し、ワシントンD.C.のタンパク質研究所所長を務める著名な計算生物学者、デイビッド・ベイカー氏のチームは、様々なタンパク質標的に対する高親和性大環状ペプチドコンジュゲートを設計するための革新的な拡散モデルベースの技術「RFペプチド」を開発しました。

具体的には、この技術は、改良型RoseTTAFoldとRFdiffusionを環状相対位置エンコーディングと組み合わせ、高精度なマクロサイクル骨格を生成します。ProteinMPNNとRosetta Relaxを統合し、配列最適化を行うことで、標的を絞った効率的なマクロサイクル設計を可能にし、医薬品開発と診断技術の新たな可能性を切り開きます。「ディープラーニングを用いた高親和性タンパク質結合マクロサイクルの正確なde novo設計」と題されたこの研究は、bioRxivにプレプリントとして掲載されています。

研究のハイライト:

• RFペプチドは、αヘリックス、βシート、リング構造などのさまざまな二次構造を持つマクロサイクルの設計に優れており、特定のタンパク質インターフェースに合わせてカスタマイズできるため、治療および診断アプリケーションが進歩します。
• MCL1、MDM2、GABARAP、およびRbtAを標的とするRFペプチドで設計されたマクロサイクルはすべて、高い結合親和性を示しました。
• RF ペプチドにより、構造が解明されていないタンパク質の de novo コンジュゲートの設計が可能になり、十分に調査されていないタンパク質や構造が特徴付けられていないタンパク質をターゲットとする設計ルールが変更されます。

論文の宛先:
https://doi.org/10.1101/2024.11.18.622547

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データセット: MCL1、MDM2、GABARAP、および RbtA をターゲットとし、マクロ環状分子の設計のためのターゲットタンパク質を選択します。

研究チームは、大環状コンジュゲートのde novo設計研究において、抗がん治療に不可欠なタンパク質であるMCL1を最初にターゲットとしました。RFpeptides技術を用いて、9,965種類の多様な環状ペプチドバックボーンを生成し、ProteinMPNNとRosetta Relax設計パイプラインを用いて、各バックボーンに4つのアミノ酸配列を設計しました。ディープラーニングと基本的な物理的指標に基づくスクリーニングの後、最終的に27のデザインが実験的特性評価のために選定されました。

本研究では、腫瘍抑制タンパク質p53と相互作用するMDM2も標的とし、10,000個のマクロ環状骨格を生成し、各骨格について4アミノ酸配列を設計した。AfCycDesignによって予測された40,000個の設計のうち、7,495個がMDM2に効果的に結合すると考えられた。

GABARAPのマクロ環状化合物を設計するにあたり、研究チームは6つのホットスポット残基を定義し、20,000個のマクロ環状骨格を生成し、アミノ酸配列を設計した。80,000個の設計のうち、335個のマクロ環状化合物がさらなる研究のために選定された。

RbtAについては、研究チームはAF2とRF2を用いて構造を予測し、7つのホットスポット残基を定義し、20,000個の主鎖を生成し、各主鎖に対して4つのアミノ酸配列を設計しました。この設計プロセスでは、Iterative ProteinMPNNとRosetta Relaxが使用されました。

RFpeptides: タンパク質をターゲットとした大環状化合物の新規設計のための生成的ディープラーニング パイプライン。

RFpeptidesは、標的を絞った効率的な大規模ループ設計を可能にします。具体的には、改良型RoseTTAFoldとRFdiffusionを巡回相対位置エンコーディングと組み合わせて利用することで、正確な大規模ループスケルトンを生成し、ProteinMPNNとRosetta Relaxを統合して配列最適化を行います。

RFペプチドの設計フロー

RFペプチド: RoseTTAFold2とRFdiffusionに基づくさらなる拡張

本研究では、まずRoseTTAFold2（RF2）構造予測ネットワークが既知の環状ペプチド構造をモデル化する能力を評価しました（下図A参照）。研究者らは、環状相対位置エンコーディング機構を導入することでRF2に重要な改良を加え、天然環状ペプチド構造の堅牢な予測が可能であることを観察しました。

RF2構造予測ネットワークの主な改良点

この成功を受けて、研究者らは、類似したネットワーク構造を持つ環状相対位置エンコーディングが、RFdiffusionによる大環状ペプチド構造の生成にも有効である可能性があると推測しました。そのため、上図BCに示すように、本研究ではRFdiffusionに環状相対位置エンコーディングを追加し、多様な大環状ペプチドの堅牢な生成を観察することに成功しました。

研究チームは、環状相対位置エンコーディングの移植性に着想を得て、RFdiffusionをタンパク質結合性マクロサイクルのde novo設計に用い始めました。図Dに示すように、本研究では、環状相対位置エンコーディングを用いて、RFdiffusionタンパク質設計パイプラインにおいて生成された鎖のコーディングを提供します。次に、図Eに示すように、ProteinMPNNを用いてマクロサイクル骨格に一致するアミノ酸配列を設計し、RFペプチドの構築を完了します。図Fに示すように、 RFペプチドは、タンパク質を標的とした多様な二次構造を持つマクロサイクル化合物を迅速に生成できます。

RFペプチド：タンパク質結合マクロサイクルの設計プロセス

大環状化合物：RFペプチドに基づく製品の設計と精密スクリーニング

この研究では、RFペプチドを使用してさまざまなターゲットに対して多様なマクロ環状化合物バックボーンを生成した後、ProteinMPNNとRosetta Relaxを使用して生成されたバックボーンをローカルで変更し、アミノ酸配列の多様性を実現しました。

まず、研究者らは、iPAE、モデル類似性評価、および RF2 支援スクリーニングに基づいて、マクロ環状配列と標的構造をテンプレートとして使用して設計されたタンパク質マクロ環状複合体を AfCycDesign で再予測し、高い信頼性で設計を選択しました。

第二に、この研究では、Rosettaを使用して結合親和性（ddG）、設計されたマクロサイクルの空間凝集傾向（SAP）、界面接触の分子表面積（CMS）などの品質指標を計算し、候補のスクリーニングを精緻化しました。

最終的に、研究者らは選ばれた設計の中からいくつかを選び、化学合成と生化学的特性評価を通じて、実験における結合親和性を明らかにしました。その後、設計の比較検証を行い、その正確性と有効性を確認しました。

精度はほぼ完璧であり、RFペプチドの組み合わせによる予測力が検証されています。

MCL1およびMDM2用の大環状化合物の設計と特性評価

RFペプチドの有効性を検証するため、研究者らはまず骨髄性白血病タンパク質1（MCL1）を最初の標的タンパク質として選択し、実験的特性評価を行いました。図A～Bに示すように、 MCB_D2（紫色）がMCL1（灰色の表面）に最も強く結合し、結合親和性は2μMであることが分かりました。

マクロサイクルが設計通りに結合していることを確認するため、研究者らはMCB_D2-MCL1結合のX線結晶構造を決定した。図Cに示すように、結晶構造は設計モデルとほぼ一致し、Cα RMSDは0.7Åであった。図Dに示すように、マクロサイクルが結晶構造と重なり合う場合のCα RMSDは0.4Åであり、結晶構造中の相互作用残基の側鎖構造も設計モデルに非常に近い。さらに結晶構造を解析した図Eおよび図Fでは、MCB_D2のリング領域とMCL1の間に疎水性接触とカチオン-π相互作用が存在することが明らかになった。

MCL1のマクロ環状化合物の新規設計と特性解析

MCL1が環状分子に結合するという実験的検証に着想を得て、研究チームはMDM2の複合体の設計に着手しました。図GIに示すように、研究者らはMDB_D8がMDM2にとって最適な大環状化合物であり、1.9 μMという高い親和性を示すことを発見しました。さらに、計算モデルによって予測された重要な界面接触は、天然のMDM2-p53複合体の構造で観察される相互作用と類似しています。

MDM2のマクロ環状化合物の新規設計と特性解析

GABARAPを標的とした大環状化合物の設計と特性評価

RFペプチドをさらに分析するために、研究者らはMCL1およびMDM2とはまったく異なる結合部位を持つ化合物、γ-アミノ酪酸A型受容体関連タンパク質（GABARAP）を設計しました。

図ABおよびDEに示す実験結果は、 GAB_D8とGAB_D23がGABARAPL1に対してそれぞれ6 nMおよび36 nMの親和性を示し、有効な化合物であることを示しています。GAB_D8は現在発見されているGABARAPL1に対する最も有効な大環状化合物です。図CおよびFに示すように、X線結晶構造解析により、GAB_D8-GABARAPL1複合体の構造は設計モデルと高い整合性を示し、GAB_D23-GABARAP複合体の構造も設計モデルと密接に一致することが明らかになりました。これは、設計モデルにおける主要な相互作用の精度を検証するものです。

GABARAPに対する高親和性大環状化合物の新規設計

一部の領域では設計モデルと結晶構造の間に微妙な差異が見られるものの、多重配列アライメント（MSA）に基づく予測はX線結晶構造と高い一致を示しています。下の図GIに示すように、これらの微妙な差異にもかかわらず、MSA予測は実験的に得られた結晶構造とよりよく一致しています。

GAB_D8/GAB_D23とGABARAPを組み合わせたX線結晶構造

RbtA構造が未知の大環状化合物の設計と特性評価

本研究では、実験構造が未知である標的タンパク質に対するマクロ環状化合物の設計も開始し、RFペプチドが設計リスクを効果的に低減できるかどうかを検証しました。RbtAを例に挙げ、研究者らはまずAF2とRF2を用いてタンパク質構造を予測しました。どちらの方法も全体的な構造は類似していました。これに基づき、研究者らはAF2とRF2の予測結果がほぼ一致する領域を標的とするRFペプチドを設計しました。図A～Bに示すように、 RBB_D10はRbtAに対して効果的なマクロ環状化合物であり、9.4 nMの結合親和性を示すことが示されました。

RbtA構造を標的とした高親和性環状ペプチド複合体の精密な新規設計

RbtAとRBB_D10の結合様式を確認するため、研究者らはアポとRbtAの組み合わせの高解像度X線結晶構造をさらに解析しました。上図Cに示すように、 X線結晶構造解析により、アポ構造と予測構造（RMSD 1.2Åと1.1Å）の間に高い整合性が確認され、上図Dに示す複合構造は設計モデル（RMSD 1.4Å）とほぼ完全に一致しました。上図4E～Hに示すように、大環状化合物のX線構造は設計モデル（RMSD 0.4Å）とほぼ一致し、いずれも設計モデルの精度を検証しました。

デイヴィッド・ベイカー：神の手からノーベル賞受賞者へ

ノーベル化学賞受賞者であるデイビッド・ベイカー氏は、タンパク質研究分野において間違いなく著名な人物です。人工知能によるタンパク質構造予測の重要人物として、デイビッド・ベイカー氏はタンパク質構造予測の進歩を大きく前進させただけでなく、タンパク質設計の分野においても目覚ましい成果を上げています。

2003年、デイビッド・ベイカー率いるチームは、天然由来ではない初の新規タンパク質「Top7」を設計しました。この成果は科学界を驚かせただけでなく、de novoタンパク質設計の分野における画期的な進歩となりました。

原著論文: 10.1126/science.1089427

Top7の設計は注目に値するものの、特定の構造に基づいているだけで、実用的な機能は備えていません。David Baker氏はそこで止まらず、彼とチームは探求を続け、タンパク質エネルギーを計算する関数、複数のバックボーンと側鎖のサンプリング法、モンテカルロシミュレーションや連続最適化法などのグローバル最適化アルゴリズムなど、様々な計算手法を試しました。

生成AIと機械学習技術の発展により、特定の生物学的機能を持つ新規タンパク質の設計がますます可能になりつつあります。 2024年6月、David Baker教授率いるチームは、線維芽細胞増殖因子（FGF）シグナル伝達経路を制御し、血管新生を促進する新規環状タンパク質を設計するという、新たなブレークスルーを達成しました。この研究は、de novoタンパク質設計の応用範囲を拡大するだけでなく、この分野の発展に大きな影響を与える可能性があります。

原著論文:

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(24)00534-8

デイビッド・ベイカー氏の研究は、タンパク質設計の分野を大きく前進させました。彼のde novoタンパク質設計における画期的な進歩は、私たちが新たな時代、すなわち人類が生命の基本構成要素を精密に操作できる時代の入り口に立っていることを示唆しています。これらの技術の開発と応用は、様々な地球規模の課題を解決する可能性を秘めています。